Nipsnap2基因敲除心肌肥厚小鼠模型
討論與結論
目前Nipsnap2蛋白及其所屬的Nipsnap蛋白家族功能的研究較少，其模型中的作用未見報道，該項目屬于原創性發現。此模型的建立為研究該基因提供了依據。我們研究發現，在動物水平上，敲除Nipsnap2基因，對心肌肥厚病理進程有顯著的加重作用。通過對Nipsnap2基因功能的深入研究，將明確NIPSNAP2在心肌肥厚過程中調控代謝的分子機制，為通過代謝重塑臨床防治心肌肥厚及心力衰竭提供新的實驗證據及分子靶點。
生物安全性
模型動物飼養在武漢大學人民醫院動物房SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。
（1）建筑特點
門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時針走向設計。屏障系統內共有大鼠飼養室1間，小鼠飼養室3間，隔離觀察室1間，實驗準備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統外配有監控室、機房和配電室等。
（2）設計參數
室內溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數：≤3個/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時間：12/12h。
（3）通風和空調系統
動物實驗室采用全新風中央空調通風系統。空氣經過初、中、三級過濾器后進入實驗室內環境。
（4）照明系統
一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動物飼養室、實驗準備間、隔離觀察室和功能實驗室等安裝有手動和自動開關，根據實際需要，調節控制室內照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點和晚上8點開啟紫外線燈照射1h。
（5）通訊系統
因為SPF級動物實驗室的環境和設施具有特殊要求，人員進入后不能隨意出入，而室內外的聯系又十分重要，故室內各房間均安裝內部電話機，按照房間順序編排電話號碼，各室內電話可相互連通，并均與監控室總機保持聯系，保證實驗室內外信息的及時溝通。
（6）監控系統
對SPF級動物實驗室的出入口、走道、實驗動物飼養室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉的攝像機，能夠及時了解設施的運行狀態；也能有效督促實驗人員執行科學的操作規程，避免人為因素造成室內環境和設施的污染；并對整個實驗期間的動物狀態和反應進行觀察，減少對動物的滋擾。
（7）供水系統
SPF級實驗動物飲用水以純凈水為宜。本實驗室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統內實驗準備室，設置接水槽，為實驗動物供應滅菌的飲用水和屏障系統內用水。要經常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當比例的84消毒液。
（8）供電系統、警報系統和消防設施
SPF級動物實驗室要求全天候不間斷供風和供電，如果出現故障，不能及時發現和處理，就可能導致環境設施的污染、動物感染或死亡，造成嚴重后果。因此應對SPF級動物實驗室使用獨立穩定的供電系統，并配備有應急電源。在中央空調機房控制室安裝風機故障警報系統，以便及時檢修和維護，保證設施的安全運行。
（9）消毒滅菌設備
為防止外界物品進入SPF級動物實驗室時所攜帶的細菌污染室內環境和造成動物交叉感染，按照不同物品的特性，進行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或專用的機動門真空滅菌器消毒。
（10）動物飼養籠具
飼養大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養有特殊要求的實驗動物，配有底盤和食槽，確保實驗動物有充足的采食和活動空間，同時也保證室內環境的清潔。
（11）墊料的選擇和使用
在使用塑膠墊料時，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術后的恢復、生長發育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。
（12）飼料配制
大小鼠的生產型飼料和維持型飼料必須嚴格按照國家標準，進行科學配制生產。每半年檢測一次飼料的微生物指標和有效營養成分指標，保證飼料的質量。
評價驗證
圖1. Nipsnap2敲除鼠鑒定結果圖雜合子：雙帶，其中一條帶是缺失200bp；純合子：單條帶，兩條帶均缺失200bp。 2. 敲除Nipsnap2基因加重TAC所誘導的心肌肥厚水平 TAC手術四周后，Nipsnap2敲除鼠的心臟重量相比于sham組顯著增大，左心室后壁厚度增加，并且在心肌肥厚進程加重（圖2A-E）。心臟超聲檢測小鼠心臟結構和功能發現，敲除Nipsnap2后，加重了TAC手術導致的心肌肥厚，主要表現為左心室射血功能EF和FS的影響（圖2D-E）。取各小組小鼠的心臟組織提取總RNA，結果如圖2I-J所示，TAC手術后小鼠心肌肥厚標志物Anp和Bnp表達水平顯著升高，Nipsnap2敲除后加重了這樣的變化。
圖2. 敲除Nipsnap2基因加重TAC所誘導的心肌肥厚水平
A-B．敲除Nipsnap2基因對小鼠心臟結構改變：A.小鼠心臟示意圖；B.小鼠心臟整體重量與體重比值分析；
C-H．心臟超聲檢測Nipsnap2基因敲除小鼠心臟功能改變：C.TAC術后四周小鼠M型超聲心動圖；D.心臟超聲檢測的EF值結果；E.心臟超聲檢測的FS值結果；F. LVPWd (mm)為左心室舒張末后壁厚度；G.IVPWs(mm)；H.IVIDd (mm) ；
I-J．QPCR檢測心肌肥厚的標志物Anp和Bnp在mRNA水平變化：I.Anp；J.Bnp。
Sham:假手術組；TAC：TAC手術組；WT：野生型小鼠；KO：Nipsnap2敲除鼠；*：p<0.05.
制備方法
1. 利用CRISPR/Cas9技術，設計并體外轉錄gRNA, 將Cas9、gRNA同時注射到小鼠的受精卵中。Cas9蛋白在gRNA引導下結合到靶位點進而造成DNA雙鏈斷裂，從而實現靶位點堿基序列缺失，實現基因敲除。guide RNA設計：
guideRNA信息:
· Nipsnap2（ko） -sgRNA1： TTGTCAGAAAGGTCGATCCAAGG
· Nipsnap2（ko） -sgRNA2： TTCAGTTCACAACGTTAAGCCGG
2. 建立主動脈縮窄建立小鼠心肌肥厚模型（TAC手術），通過超聲心動圖評價心臟功能，小鼠采用異氟脘吸入麻醉，將小鼠左胸前區剃毛，涂抹耦合劑，取仰臥位對小鼠行超聲檢查。采用高頻超聲診斷儀（VET V6，VINNO，中國），頻率為12.5MHz，選取標準左心室乳頭肌短軸切面，測量各項指標。
3．小鼠心臟組織切片形態及病理檢測 稱取小鼠體重，小鼠經心臟灌注，取出心臟后用濾紙吸干血液后稱重，計算心臟重量與體重的比值（Heart weight/body weight，HW/BW）。
4．心肌肥厚分子標志物檢測將各實驗組小鼠心室肌組織分別提取總RNA，應用qPCR檢測心肌肥厚指標Anp、Bnp、Myh6、Myh7的mRNA水平。
研究背景
模型信息
中文名稱:Nipsnap2基因敲除心肌肥厚小鼠模型
英文名稱:Mouse model of Nipsnap2 gene knockout cardiac hypertrophy disease
類型:心肌肥厚動物模型
分級:NA
用途:為通過代謝重塑臨床防治心肌肥厚及心力衰竭提供新的實驗證據及分子靶點。
研制單位:武漢大學
保存單位:武漢大學
