SLC16a3基因敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技術(shù)的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外顯子或幾個總要的外顯子功能區(qū)敲除掉，獲得全身所有的組織和細(xì)胞中都不表達(dá)該基因的小鼠模型。SLC16a3基因敲除小鼠模型為完全性基因敲除模型（KO），該模型應(yīng)用范圍廣，可以制造針對各類疾病不同組織器官細(xì)胞的疾病模型。

模型動物飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物房SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點

門采用專用凈化密閉門并配備觀察窗。單向走道呈順時針走向設(shè)計。屏障系統(tǒng)內(nèi)共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實驗準(zhǔn)備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機(jī)房和配電室等。

（2）設(shè)計參數(shù)

室內(nèi)溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強(qiáng)梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級；菌落數(shù)：≤3個/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時間：12/12h。

（3）通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)

動物實驗室采用全新風(fēng)中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)。空氣經(jīng)過初、中、三級過濾器后進(jìn)入實驗室內(nèi)環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動物飼養(yǎng)室、實驗準(zhǔn)備間、隔離觀察室和功能實驗室等安裝有手動和自動開關(guān)，根據(jù)實際需要，調(diào)節(jié)控制室內(nèi)照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點和晚上8點開啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因為SPF級動物實驗室的環(huán)境和設(shè)施具有特殊要求，人員進(jìn)入后不能隨意出入，而室內(nèi)外的聯(lián)系又十分重要，故室內(nèi)各房間均安裝內(nèi)部電話機(jī)，按照房間順序編排電話號碼，各室內(nèi)電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機(jī)保持聯(lián)系，保證實驗室內(nèi)外信息的及時溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對SPF級動物實驗室的出入口、走道、實驗動物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉(zhuǎn)的攝像機(jī)，能夠及時了解設(shè)施的運行狀態(tài)；也能有效督促實驗人員執(zhí)行科學(xué)的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內(nèi)環(huán)境和設(shè)施的污染；并對整個實驗期間的動物狀態(tài)和反應(yīng)進(jìn)行觀察，減少對動物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級實驗動物飲用水以純凈水為宜。本實驗室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內(nèi)實驗準(zhǔn)備室，設(shè)置接水槽，為實驗動物供應(yīng)滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內(nèi)用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當(dāng)比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報系統(tǒng)和消防設(shè)施

SPF級動物實驗室要求全天候不間斷供風(fēng)和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導(dǎo)致環(huán)境設(shè)施的污染、動物感染或死亡，造成嚴(yán)重后果。因此應(yīng)對SPF級動物實驗室使用獨立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應(yīng)急電源。在中央空調(diào)機(jī)房控制室安裝風(fēng)機(jī)故障警報系統(tǒng)，以便及時檢修和維護(hù)，保證設(shè)施的安全運行。

（9）消毒滅菌設(shè)備

為防止外界物品進(jìn)入SPF級動物實驗室時所攜帶的細(xì)菌污染室內(nèi)環(huán)境和造成動物交叉感染，按照不同物品的特性，進(jìn)行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或?qū)Ｓ玫臋C(jī)動門真空滅菌器消毒。

（10）動物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點。通用的不銹鋼籠具長、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實驗動物，配有底盤和食槽，確保實驗動物有充足的采食和活動空間，同時也保證室內(nèi)環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術(shù)后的恢復(fù)、生長發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行科學(xué)配制生產(chǎn)。每半年檢測一次飼料的微生物指標(biāo)和有效營養(yǎng)成分指標(biāo)，保證飼料的質(zhì)量。

鑒定PCR結(jié)果圖解：

項目設(shè)計：

Slc16a3基因有8個轉(zhuǎn)錄本。根據(jù)Slc16a3基因的結(jié)構(gòu)，將Slc16a3-201(ENSMUST00000070653.12)轉(zhuǎn)錄本的外顯子2-外顯子5作為敲除區(qū)域，該區(qū)域含有起始密碼子ATG編碼序列，敲除該區(qū)域會導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的紊亂。利用CRISPR/CAS9技術(shù)對SLC16a3基因進(jìn)行修飾。方法如下：體外轉(zhuǎn)錄sgRNA，將sgRNA顯微注射到C57BL/6JGpt小鼠受精卵中，移植受精卵，獲得陽性F0小鼠，經(jīng)PCR和測序證實。將F0代陽性小鼠與C57BL/6JGpt小鼠雜交，獲得穩(wěn)定的F1代小鼠模型。

項目策略圖：

一、疾病概述 肥厚型心肌病 ( Hypertrophic cardiomyopathy) 是一種器質(zhì)性心臟疾病，主要表現(xiàn)為左心室和(或)右心室及室間隔不對稱肥厚、心室腔變小、心室順應(yīng)性降低。 病因：肥厚型心肌病是常染色體顯性遺傳性疾病，60%～70%為家族性，30%～40%為散發(fā)性，家族性病例和散發(fā)病例、兒童病例和成年病例具有同樣的致病基因突變。臨床表現(xiàn)：1. 以青壯年多見、常有家族史。2. 可以無癥狀，也可以有心悸、勞力性呼吸困難、心前區(qū)悶痛、易疲勞、暈厥甚至猝死，晚期出現(xiàn)左心衰的表現(xiàn)。3. 梗阻性肥厚型心肌患者胸骨左緣可出現(xiàn)粗糙的收縮中晚期噴射性雜音，可伴震顫，應(yīng)用洋地黃制劑、硝酸甘油、靜點異丙腎上腺素及Valsalva動作后雜音增強(qiáng)，反之應(yīng)用β受體阻滯劑、去甲腎上腺素、下蹲時雜音減弱。有些病人聞及S3及S4心音及心尖區(qū)相對性二尖瓣關(guān)閉不全的收縮期雜音。臨床診斷：超聲心動圖提示左心室壁或（和）室間隔厚度≥15mm，排除了其他引起心肌肥厚的原因如高血壓病、風(fēng)濕性心臟病二尖瓣病、先天性心臟病（房間隔、室間隔缺損）及代謝性疾病伴發(fā)心肌肥厚。二、模型背景1、SLC16a3基因信息? 敲除基因名稱（NCBI號）：80879? 敲除基因NCBI網(wǎng)址鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/80879? 敲除基因名稱（MGI號）：SLC16a3（MGI: 1933438）? 敲除基因Ensembl網(wǎng)址鏈接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?g=ENSMUSG00000025161;r=11:120948480-120960868? 方案針對的轉(zhuǎn)錄本（Ensembl號）： ENSMUSG00000025161? 方案敲除的exon：exon2-exon52、實驗動物背景信息所采用的小鼠品系為C57BL/6。來源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號與雄鼠52號交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個亞系。1985年從Olac引到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所。毛色：黑色。主要特性：①乳腺腫瘤自然發(fā)生率低，化學(xué)物質(zhì)難以誘發(fā)乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無眼。用可的松可誘發(fā)腭裂，其發(fā)生率達(dá)20%。③對放射物質(zhì)耐受力中等;補(bǔ)體活性高;較易誘發(fā)免疫耐受性。④對結(jié)核桿菌敏感。對鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產(chǎn)量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類脂質(zhì)濃度低。對百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認(rèn)作"標(biāo)準(zhǔn)"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。主要用途：是腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)研究中常用的品系。3、研究背景 該動物模型的研究目的及意義：探究SLC16a3在結(jié)核病病理過程中所發(fā)揮的作用及相關(guān)機(jī)制，從而為結(jié)核病的防治提供新見解。 SLC16a3是SLC16基因家族的一個成員，SLC16家族成員參與廣泛的代謝途徑，包括大腦，骨骼肌，心臟和腫瘤細(xì)胞的能量代謝，糖異生，T淋巴細(xì)胞活化，腸代謝，精子形成，胰腺β細(xì)胞功能異常，甲狀腺激素代謝和藥物轉(zhuǎn)運，其中SLC16a3編碼單羧酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白（MCT4）催化質(zhì)子聯(lián)結(jié)的質(zhì)子傳遞的單羧酸鹽，如乳酸，丙酮酸和酮體穿過質(zhì)膜。在LPS處理的樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有增強(qiáng)有氧糖酵解作用，并發(fā)現(xiàn)在調(diào)節(jié)這些細(xì)胞活化中起重要作用。盡管細(xì)胞外乳酸的生物學(xué)活性已得到充分研究，人們對乳酸鹽的輸出是如何調(diào)節(jié)的，或者在炎性激活過程中乳酸鹽的輸出是否會影響糖酵解的研究較少，本研究通過研究Slc16a3的功能，深入完善乳酸鹽的調(diào)節(jié)作用。參考文獻(xiàn)：1. Geissmann F., Manz M. G., Jung S., Sieweke M. H., Merad M., Ley K.(2010) Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science 327, 656–6612. Medzhitov R. (2008) Origin and physiological roles of inflammation. Nature 454, 428–4353. Takeuchi O., Akira S.(2010) Pattern recognition receptors and inflammation. Cell 140, 805–8204. Kawai T.,Akira S. (2010) The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors. Nat. Immunol. 11, 373–3845. Medzhitov R.,Horng T. (2009) Transcriptional control of the inflammatory response. Nat. Rev. Immunol. 9, 692–7036. Jeannin P., Jaillon S., Delneste Y. (2008) Pattern recognition receptors in the immune response against dying cells. Curr. Opin. Immunol. 20, 530–5377. Vallabhapurapu S., Karin M. (2009) Regulation and function of NF-κB transcription factors in the immune system. Annu. Rev. Immunol. 27, 693–7338. Nathan C., Ding A. (2010) Nonresolving inflammation. Cell 140, 871–8829. Hennessy E. J.,Parker A. E., O'Neill L. A. (2010) Targeting Toll-like receptors: emerging therapeutics? Nat. Rev. Drug Discov. 9, 293–30710. Koppenol W. H., Bounds P. L., Dang C. V. (2011) Otto Warburg's contributions to current concepts of cancer metabolism. Nat.Rev. Cancer 11, 325–33711. DeBerardinis R. J., Lum J. J., Hatzivassiliou G., Thompson C. B. (2008) The biology of cancer: metabolic reprogramming fuels cell growth and proliferation. Cell Metab. 7, 11–2012. DeBerardinis R. J., Thompson C. B. (2012) Cellular metabolism and disease: what do metabolic outliers teach us? Cell 148, 1132–114413. Pearce E. L., Poffenberger M. C., Chang C. H., Jones R. G. (2013) Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science 342, 1242454