CTLA4人源化小鼠模型
討論與結論
抗體療法是很受關注的免疫療法之一，在研究治療性抗體的效果時，可以使用免疫系統人源化小鼠進行研究。如使用免疫缺陷小鼠進行人外周血重構，從而在小鼠中建立功能正常的人免疫系統。雖然這種模型可以用于篩選抗體的潛在抗癌作用，但在評估其它臨床參數，如自身免疫性方面受到一定限制。并且免疫系統人源化小鼠容易產生移植物抗宿主病，或需要人細胞因子刺激使移植后的細胞存活增殖。相比之下，CTLA4基因人源化小鼠的免疫應答是在自然環境中產生的。并且，CTLA4基因人源化小鼠模型可以用于評估與潛在人類治療性抗體相關的自身免疫副作用的能力。
因此，本研究建立的CTLA4人源化小鼠模型改善了CTLA4在人與小鼠中種屬差異導致的實驗結果差異，從而使藥物評價的結果更加客觀，為治療性抗體的驗證提供了更有價值的實驗動物模型。
生物安全性
模型制作及動物實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為BL18003。本實驗部分使用了基因修飾動物（基因敲入），只在規定的SPF級動物設施內飼養，飼養過程有防逃逸的措施，如擋鼠板等。動物在離開動物設施后，進行完相關試驗后，立即進行處死，取材。動物尸體暫存于-20℃冰箱中，經有資質的公司運走統一處理。
評價驗證
4.1CTLA4人源化小鼠模型的建立
將F0代小鼠與C57小鼠進行雜交，獲得雜合子hCTLA4 h/m,將雜合子互交并將子代進行基因型鑒定（圖2），得到純合敲入小鼠hCTLA4 h/h。
圖2 PCR鑒定子代小鼠基因型
注：使用PCR鑒定子代小鼠基因型，突變可傳代。M：Marker（TaKaRa，DL2000）；H: 水。h/h：CTLA4人源化純合子小鼠；h/m：ctla4人源化雜合子小鼠；m/m：野生型小鼠。
4.2CTLA4人源化小鼠組織中蛋白及mRNA表達
為了鑒定轉基因小鼠是否在蛋白水平發生CTLA4人源化，取1-2月齡小鼠脾、肺進行Western Blot，分別使用種屬反應性為小鼠、大鼠和人，以及種屬反應性為人的CTLA4抗體檢測蛋白表達（圖3a）。結果顯示，市售的種屬反應性為人的CTLA4抗體無法區分人源與鼠源的蛋白。
因為市售蛋白抗體無法區分人源與小鼠源CTLA4蛋白，使用RT-PCR鑒定人源化小鼠脾細胞（CD3抗體刺激4天）中mRNA表達（圖3b）。結果可見人特異性引物（hCTLA4-F: 5’CCCTGCACTCTCCTGTTTTTTCT，hCTLA4-R: 5’TTGATTTCCACTGGAGGTGCC）只能擴增純合子hCTLA4 h/h的cDNA，而小鼠特異性引物（mCTLA4-F: 5’CCTTTTGTAGCCCTGCTCACT, mCTLA4-R: 5’TTCACTCTGCTTTCATTAAAGGTAC。）也只能擴增hCTLA4 m/m的cDNA，可見ctla4人源化轉基因小鼠中只表達人源CTLA4的mRNA。
圖3CTLA4在人源化小鼠中的蛋白及mRNA表達
注：m/m：野生型小鼠；h/h：CTLA4人源化純合子小鼠。a：Western Blot 檢測CTLA4蛋白在脾和肺中的表達，CTLA4：種屬反應性為小鼠、大鼠和人的CTLA4抗體，；hCTLA4：種屬反應性為人的CTLA4抗體。b：RT-PCR檢測CTLA4mRNA在脾中的表達，
4.3人源CTLA4基因可正常替代小鼠CTLA4基因
文獻報道，CTLA4基因敲除小鼠會由于嚴重的自身免疫疾病，在出生后3-4周內死亡。但在CTLA4人源化小鼠中，沒有觀察等到淋巴細胞的浸潤（圖4g-l），并且根據我們的觀察結果表明，純合的CTLA4人源化小鼠壽命正常，在10個月內沒有觀察到自身免疫性疾病發展的跡象。因此，在純合的CTLA4人源化小鼠中，人源CTLA4等位基因已功能性替代了小鼠CTLA4基因。
圖4各組織HE染色
注：hCTLA4m/m（a-f）及hCTLA4h/h（g-l）小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胸腺中無明顯淋巴細胞浸潤。圖中顯示的是心臟（a，g）、肝（b，h）、脾（c，i）、肺（d，j）、腎（e，k）、胸腺（f，l）的組織切片HE染色。比例尺=100μm。
4.4人源化CTLA4基因小鼠免疫系統正常。
我們利用流式細胞術檢測了野生型小鼠和人源化CTLA4基因小鼠外周血中各類細胞的比例，發現其外周血中B細胞（B220+）、T細胞（CD3+、CD4+、CD8+）、粒細胞（CD11b）和NK細胞的比例都沒有明顯差異。同時檢測骨髓、脾臟和胸腺等免疫器官中免疫細胞的比例發現人源化CTLA4基因的小鼠和野生小鼠相比沒有差異。結果說明人源化CTLA4基因后沒有改變正常生理狀態下小鼠免疫系統的組成（圖5）。
圖5CTLA4在人源化小鼠外周血中不同免疫細胞的比例
注：m/m：野生型小鼠；h/h：CTLA4人源化純合子小鼠。a：流式細胞術統計不同免疫細胞在外周血中的比例。B-E：流式細胞術檢測不同免疫細胞的直方圖。
制備方法
3.1.4 模型構建流程
利用CRISPR /Cas9技術，建立CTLA4基因人源化小鼠模型，利用PCR、RT-PCR和Western Blot的方法進行鑒定及分析。
3.1.5CTLA4人源化小鼠的建立
3.1.5.1CTLA4人源化小鼠模型的建立
（1）設計方案
一、載體構建
1.sgRNA載體
載體名稱：pUC57-sgRNA expression vector
Addgene ID:51132
根據基因信息選擇靶點，合成sgRNA（上海英濰捷基）
targeting site 1:
gggttcaaacacatctcaagg
m-ctla4-gRNA up1 5’TAGGgggttcaaacacatctca
m-ctla4-gRNA down1 5’aaacTGAGATGTGTTTGAACCC
targeting site2:
gagacttctggaacatggaGg
m-ctla4-gRNA up2 5’TAGGgagacttctggaacatgg
m-ctla4-gRNA down2 5’aaacCCATGTTCCAGAAGTCTC
合成的sgRNA單鏈通過退火復性結合成小片段，插入BSAⅠ線性化的載體
sgRNA插入位點示意圖
圖1CTLA4人源化小鼠模型構建設計方案
構建完成的sgRNA載體通過體外轉錄成為可注射的sgRNA。（體外轉錄用試劑盒：Ambion Am1354）
2，CAS9載體
載體名稱：pST1374-NLS-flag-linker-Cas9
Addgene ID: 44758
載體通過體外轉錄成為可注射的Cas9-RNA（體外轉錄用試劑盒：Ambion Am1345）
顯微注射：
1、超數排卵：15只3-4周齡c57雌鼠注射激素進行超排。
2、受精卵注射：取約150枚受精卵進行注射。
3、雄鼠結扎：制作30只8周齡輸精管結扎的c57雄鼠。
4、受體鼠制備：8-10周齡ICR雌鼠與結扎的ICR雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。
5、胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，120枚卵，4只受體鼠）。
基因型鑒定：
1、剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進行編號及取材。
2、基因組DNA提取： 使用全式金（Transgen）公司的基因組DNA提取試劑盒（EE101-12）提取基因組DNA
3、PCR檢測：根據序列信息設計檢測引物（上海英濰捷基）
M-CTLA4-KO-S 5’AGAAATTATACTCTCCAAGACTCCACG
M-CTLA4-KO-A 5’CCTTAAGTCCCAGCTGAGATCC
KO：
TM=62℃WT：727bp ko:(見測序分析)
PCR反應體系及擴增程序（TaKaRa RR042A）
反應體系：
l10×LA PCRBufferⅡ(Mg2+ Plus)
l2.0μl
ldNTP Mixture(2.5μM)
l1.6μl
l引物-S（50μM）
l0.2μl
l引物-A（50μM）
l0.2μl
l模板DNA
l2.0μl
lLA Taq
l0.2μl
l補加ddH2O至總體積
l20.0μl
擴增程序：
l95℃
l15 min；
l95℃, 30 s
lTM-2℃, 30 s
l72℃, 2 min 30循環；
l72℃
lmin；
6×loading buffer終止反應。
用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。
4、結果分析： 選取PCR檢測分子量不同于野生型條帶的(下圖中箭頭所示)，將PCR產物進行TA克隆，之后用檢測引物進行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。
1-23#基因組PCR結果圖（TaKaRa marker DL2000）（上游PCR結果）
1-23#基因組PCR結果圖（TaKaRa marker DL2000）（下游PCR結果）
5、測序結果：
KI：3#，5#，9#，14#，23#
黃色綠色為檢測引物，藍色字體為同源序列，紅色為H-CTLA4基因ORF，灰色為BGH poly A
ctaccactgagctacatctatacctctgagctgtgtcttcattgctgaggtatatgaactacgtctctatcactgagctgtgcctccaagttttaagtttctacctttgaaaatttttactattttttttaaaagcccatcctcctgtggaggttttaaatgtcttttcatttggattgactttctctgggccatccacaactttattttgccgttgttacagttttaaaagcatctggtttatttcccaacggacaaaaccagaggcccctttccctgttttgtgtgtgtgtgtttgtgtgtgcatatgtgtgcatgcatgtgcatgtacaaatgtgtgtgtgtctttcatttcttgtgattttggcatttttctctcagtaaaatactaagtggagttaggcaaaaataaacccttttgtgtactgaggggctcatagaaggacacaatttttcttggtgccttccaaagagaaattcagacatcagctccaggactaagagggatggccatgggacgctaagtaagagtactgggggattaaagatgaccagatgactggataaagttgggactgggatttagggattccttgtactacagaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaAgcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccgccaccatggcttgccttggatttcagcggcacaaggctcagctgaacctggctaccaggacctggccctgcactctcctgttttttcttctcttcatccctgtcttctgcaaagcaatgcacgtggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggcaaagccactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgaccttcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggccatggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacctgggcataggcaacggaacccagatttatgtaattgatccagaaccgtgcccagattctgacttcctcctctggatccttgcagcagttagttcggggttgtttttttatagctttctcctcacagctgtttctttgagcaaaatgctaaagaaaagaagccctcttacaacaggggtctatgtgaaaatgcccccaacagagccagaatgtgaaaagcaatttcagccttattttattcccatcaattgaCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaaggaaccatgagagttccttaagtcccatatgggggagaacaagttctttgtcactgctagaaaatcctgtaaagttaagagatttaaggggggcatttgaaatcgtgagtacatttgatcttgatatcacagtaacattaaggtttttctccttacccccaatcccacccccaaaacttacctaaattcaaataaataagaagttttcctcattcactttaagattttgagacactcttagttctttaaattatcacacctaaggcttaggggacatagcagaagagggggcagaaagactatgagagccaaaggtacatagagtttactgagagattgtgtctcttaggatgtcaaatggtacacccataaagtctcaccaacacgactgcctaaacttgagctgaataaggacatgaataacaatagacatacccaagtggatggggaaagaccaagatgcttcagcactatagcaataactacaggaagccaaggaatatggagagtaggaaattgccaagggaaaagcacaccagctgactatccaataa
3.1.5.2動物繁殖和表達圖譜分析
獲得F0代后，首先通過與野生型C57小鼠進行雜交，進行基因修飾小鼠傳代能力分析。之后CTLA4敲除小鼠通過雜合子與雜合子雜交，獲得CTLA4敲除小鼠純合子小鼠，進行蛋白表達分析，并用于后續實驗。
3.1.5.3 鼠尾基因組DNA鑒定
在幼崽出生后剪腳趾標記，并剪尾至1.5 mL EP管。然后參照鼠尾直接PCR試劑盒（bimake）說明書按以下程序操作。
1.1.按小鼠數量配制組織消化液，試劑比例如下：
（單樣本）
Protease Plus
2 μL
Buffer L
100 μL
組織消化液現用現配，充分混勻后使用。
1.2.向每個含有樣本的EP管中加入100 μL新鮮組織消化液，55℃水浴/金屬浴中消化15 min。組織消化時，務必將組織完全浸沒于消化液中。消化完成后，組織外觀上仍然完整，但足量的基因組DNA已經釋放，不影響后續的PCR實驗。
1.3.將樣本置于95℃水浴/金屬浴中孵育5 min以滅活消化液中的蛋白酶活性。12000 rpm離心5分鐘，取上清作為PCR模板。消化后的上清或連同組織的消化液可于-20℃保存三個月。
2. PCR擴增2.1. PCR反應體系：
PCR反應組分
20 μL反應體系(μL)
50 μL反應體系(μL)
ddH2O
8
21
正向引物(10 μM)
0.5
1
反向引物(10 μM)
0.5
1
模板（消化產物）
1
2
2 x M-PCR OPTI? Mix
10
25
注：模板體積可以適當調整。
2.2. PCR反應條件：
溫度(℃)
時間
循環數
94
5 min
1
94
20 sec
35
60
30 sec
72
X min (2kb/min)
72
5 min
1
12
--
1
3.瓊脂糖凝膠電泳試劑2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚藍染料，PCR產物可直接點樣進行瓊脂糖凝膠電泳。
研究背景
1、CTLA4基因信息
小鼠CTLA4基因位于第一號染色體的1C2區段（Chromosome 1: 60,887,000-60,915,832，ENSMUSG00000026011）
人CTLA4基因位于2q33.2。
2、實驗動物背景信息
c57bl/6小鼠也被稱為c57 black 6，1921年被培育出來，屬于近交品系。該品系的最主要的兩個特點就是品系穩定和易于繁殖。另外c57bl/6小鼠是第一個完成基因組測序的小鼠品系。
3、研究背景
細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 (cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4)（CD152）和CD28是表達在CD4 +和CD8 + T細胞的同源受體，兩者共享在抗原呈遞細胞表面表達的一對配體，并且在T細胞活化中介導相反的功能。配體與CD28相互作用，介導T細胞與T細胞受體（TCR）信號共刺激。而配體與CTLA4的相互作用可以介導T細胞功能的抑制[1]。目前，癌癥免疫療法已成為治療癌癥的有效方法，CTLA4是經過驗證的免疫檢查點的靶標之一[2]。由于CTLA4功能的重要性，因此在許多臨床前和臨床研究中都對anti-CTLA4抗體及[3]CTLA4阻滯劑進行了癌癥治療的測試[4-10]。人類和小鼠的CTLA4只具有75.16％的同源性，目前批準用于臨床的抗CTLA4抗體可以與人CTLA4結合，但不會與鼠類CTLA4交叉反應[11]。因此，構建免疫檢驗點人源化小鼠模型，使科研人員能夠研究只識別人體免疫檢驗點的藥物。并且，人源化小鼠為研究靶定人體免疫檢驗點的檢驗點抑制劑提供了可能性，并且在臨床試驗前更精準的預測藥物功效以及可能的副作用（如自身免疫，促炎癥等）。
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模型信息
中文名稱:CTLA4人源化小鼠模型
英文名稱:CTLA4 humanized mouse model
類型:人源化模型
分級:NA
用途:腫瘤抗體治療。
研制單位:中國醫學科學院醫學實驗動物研究所
保存單位:中國醫學科學院醫學實驗動物研究所
