根據(jù) Hazenberg 等[7]、 Che 等[8]的研究結(jié)果,在接種人腸道菌群 2 周后,HFA 動(dòng)物腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)豐度與志愿者菌群幾乎完全一致, 并且至少保持 5周穩(wěn)定不變。 所以本研究選擇在灌胃接種志愿者糞便菌懸液 6 周和 10 周后,收集 CON 組和 CAD 組小鼠的新鮮糞便、 血液、 組織樣品進(jìn)行檢測(cè)。 通過對(duì)腸道菌群 β-多樣性進(jìn)行分析,CON 組小鼠與健康志愿者分布在同一象限、CAD 組小鼠與冠心病患者分布在同一象限,而健康志愿者及接種了健康志愿者腸道菌群的小鼠與冠心病患者及接種了患者菌群的小鼠分布在不同區(qū)域,且 Weighted Unifrac 距離差異有顯著性。α-多樣性分析結(jié)果，CAD組的Shannon 指數(shù)在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均降低, Simpson 指數(shù)均升高，ACE 和 Chao1 指數(shù)在造模后 6 周和 10 周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值均降低, 與 CON 組比較差異有顯著性。表明志愿者腸道菌群在無菌小鼠體內(nèi)成功定植，并可形成復(fù)雜且與志愿者菌群相似的微生物區(qū)系，且CON 組、CAD 組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與豐度差異顯著。

血脂是動(dòng)脈血管壁發(fā)生病變的基礎(chǔ)物質(zhì)，高血脂既是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也是其病理表現(xiàn)，其機(jī)理可能與心肌受損后泵血功能下降導(dǎo)致的血液流變學(xué)改變相關(guān)[9-11]。Fu 等[ 12]的研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門和擬桿菌門的豐度與體質(zhì)量指數(shù)、 甘油水平、高密度脂蛋白水平呈有相關(guān)性。 Velagapudi 等[13]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)腸道菌群可影響小鼠的能量代謝和血脂水平。 我們的實(shí)驗(yàn)中,2 名冠心病志愿者的體質(zhì)量指數(shù)、血脂均高于正常值。 糞菌液接種到無菌小鼠腸道后,CAD 組動(dòng)物體重在移植后 5 周上升幅度增加, 小鼠血清中的 TG、 TC、 LDL-C 與 CON比較顯著升高。厚壁菌門和擬桿菌門是 CON 組與CAD 組腸道菌群中豐度差異最大的兩個(gè)門,結(jié)果與已有的研究報(bào)道相符。動(dòng)脈粥樣硬化是一個(gè)慢性的炎癥發(fā)展過程[ 14]，其機(jī)制目前較為認(rèn)同的是損傷反應(yīng)學(xué)說及在此基礎(chǔ)上發(fā)展出的炎癥學(xué)說,在這個(gè)過程里始終存在各種炎癥細(xì)胞和大量炎癥介質(zhì)參與[15-16]。 IL-6 作為心臟不良事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素標(biāo)志物參與易損斑塊的炎癥全程[17]。IL-10 的作用主要是在免疫應(yīng)答進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)，它可以通過直接抑制免疫細(xì)胞的功能實(shí)現(xiàn)免疫抑制[ 18]，也可以通過控制 IL-1β 產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)避免組織過度損傷[19]。 IL-2 與 IL-2 受體 α亞基結(jié)合后可調(diào)節(jié) T 淋巴細(xì)胞的活化, 而活化的 T淋巴細(xì)胞能分泌趨化因子增強(qiáng)炎癥反應(yīng),從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成及進(jìn)展[20]。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,移植冠心病患者的腸道菌群后,小鼠血清中 IL-6,IL-2 升高, IL-10 降低而被 IL-10 調(diào)節(jié)的 IL-1β 升高,驗(yàn)證了上述研究結(jié)果。 IL-4 參與粥樣硬化的機(jī)制比較復(fù)雜,目前尚無定論。 我們的結(jié)果顯示移植6 周時(shí) IL-4 已經(jīng)升高但無顯著性差異,10 周時(shí)顯著升高,說明 IL-4 參與的體液免疫可能促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明移植冠心病患者腸道菌群10 周后 HFA 小鼠的心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞已發(fā)生功能上的損傷, 導(dǎo)致血脂、 細(xì)胞因子的含量發(fā)生變化。 但由于斑塊形成是一個(gè)復(fù)雜且緩慢的過程,移植 10 周時(shí)心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞還未發(fā)生器質(zhì)性改變,故 HE 染色中未發(fā)現(xiàn)泡沫細(xì)胞浸潤(rùn)等斑塊形成的病理學(xué)變化。

理想的動(dòng)物模型應(yīng)具備以下特點(diǎn):發(fā)病過程和機(jī)制盡量接近臨床情況;能夠?qū)ο嚓P(guān)藥物或治療手段作出客觀評(píng)價(jià);模型的制備應(yīng)操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、可重復(fù)性高[21]。本研究利用糞菌移植方法建立了冠心病 HFA 小鼠模型,除腸道菌群的結(jié)構(gòu)與豐度與人類似外,體重、血脂、細(xì)胞因子含量也出現(xiàn)了與臨床類似的改變,為研究腸道菌群與冠心病關(guān)系研究提供了更多可選擇的動(dòng)物模型。

模型制備過程中涉及健康志愿者和冠心病人糞便，無高致病性病原微生物，且使用后的糞便都進(jìn)行了無害化處理，因此無生物安全隱患。

2. 1 動(dòng)物一般情況

在整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中，模型組和對(duì)照組動(dòng)物小鼠精神良好、毛色光滑、攝食飲水正常，體重平穩(wěn)增長(zhǎng)。從第 5 周開始，CAD 組動(dòng)物體重增長(zhǎng)加快，與 CON 組比較差異有顯著性( P< 0. 05) ( 圖 1) 。

圖 1 體重變化

2. 2 腸道菌群 16S rDNA 檢測(cè)結(jié)果

2. 2. 1 腸道菌群多樣性分析

根據(jù) OTUs 代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)注釋文件對(duì)比，在 97%(種) 水平上進(jìn)行 OTUs 劃分，組在造模后 6 周和 10 周時(shí)所獲得的 OTUs 數(shù)均減少，與 CON組比較差異有顯著性( P < 0. 05 )。 Shannon 指數(shù)大、Simpson 指數(shù)小表示腸道菌群的多樣性強(qiáng)，CAD 組的 Shannon 指數(shù)在造模后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均降低 ( P <0. 05，P < 0. 01 )， Simpson 指數(shù)均升高( P < 0. 05，P <0. 01)，與 CON 組比較差異有顯著性。ACE 和Chao1 指數(shù)大表示菌群豐度高, CAD 組的 ACE 和Chao1 指數(shù)在造模后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)值均降低( P <0. 05) ,與 CON 組比較差異有顯著性( 表 2)。

2. 2. 2 腸道菌群在門和屬水平上的構(gòu)成

在造模 6 周和 10 周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn) CON 組 reads主要分布在以下 8 個(gè)門: 厚壁菌門( Firmicutes )、變形菌門( Proteobacteria)、擬桿菌門( Bacteroidetes )、疣微菌門( Verrucomicrobia )、 梭桿菌門( Fusobacteria )、放 線 菌 門 ( Actinobacteria )、 藍(lán) 藻 菌 門( Cyanobacteria)、軟壁菌門( Tenericutes)。

造模 6 周時(shí)，CAD 組厚壁菌門、軟壁菌門豐度降低( P<0. 05) ,與對(duì)照組比較差異有顯著性。擬桿菌門、疣微菌門豐度升高( P < 0. 01) ,與對(duì)照組比較差異有顯著性。造模 10 周時(shí)，CAD 組厚壁菌門豐度降低( P<0. 01)，與對(duì)照組比較差異有顯著性。擬桿菌門、疣微菌門豐度升高( P < 0. 01) ,與對(duì)照組比較差異有顯著性( 圖 2)。在屬水平，對(duì)相對(duì)豐度較高的菌株進(jìn)行分析，造模 6 周時(shí)擬桿菌屬 ( Bacteroides )、 Akkermansia 菌屬相對(duì)豐度增高( P < 0. 01 )，Blautia 菌屬、Parasutterella 菌屬相對(duì)豐度降低 ( P < 0. 05, P <0. 01) ,與對(duì)照組比較差異有顯著性。造模 10 周時(shí)擬桿菌屬 ( Bacteroides )、 Akkermansia 菌屬相對(duì)豐度增高( P<0. 01)，腸桿菌屬( Lactobacillus )、 Blautia 菌屬、Parasutterella 菌屬相對(duì)豐度降低 ( P < 0. 05, P <0. 01)，與對(duì)照組比較差異有顯著性( 圖 3) 。

2. 2. 3 β-多樣性分析

β-多樣性研究是使用 Weighted Unifrac 距離來衡量組間相異系數(shù),此系數(shù)越大表示組間物種多樣性的差異越大。 分析結(jié)果顯示，CAD組在建模 6周、10 周時(shí)的 Weighted Unifrac 距離分別為 0. 658、0. 681。 表明CAD 組與 CON 組在微生物物種構(gòu)成方面存在顯著性差異( P<0. 05) ,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 圖 4A)。 CAD 組、CON 組的腸型分布在不同區(qū)域，同一組的不同階段則分布在相同區(qū)域( 圖 4B)。

2. 3 血液學(xué)指標(biāo)

CAD 組小鼠在建模 6 周和 10 周時(shí)，血液中 TG ( P < 0. 05, P < 0. 01, 圖 5A)， TC ( P < 0. 05, 圖 5B )，LDH( P<0. 01,P<0. 0001,圖 5E) 和 CK( P<0. 01,P<0. 05,圖 5F) 值均升高，與 CON 組比較差異有顯著性。 LDL-C 在建模 6 周時(shí)升高( P < 0. 05 ) , 與 CON組比較差異有顯著性，10 周時(shí)未見差異有顯著性( 圖 5D)。 HDL-C 在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未見差異有顯著性( 圖 5C) 。

2. 4 細(xì)胞因子檢測(cè)

結(jié)果顯示，與斑塊形成、進(jìn)展相關(guān)的細(xì)胞因子中，IL-6 在建模 6 周時(shí)濃度升高( P < 0. 05 )，10 周時(shí)減低( P < 0. 0001 ,圖 6 A)；IL-10 在建模 10 周時(shí)濃度降低 ( P < 0. 05 , 圖 6 E )；IL-2、 IL-4、 IL-5、 IL-1β 在建模 10 周時(shí)濃度升高 ( P < 0. 0001 , P <0. 05 ,P < 0. 0001 , P < 0. 01 , 圖 6 B, C, D, F )，與CON 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-12 p70、TNF-α、INF-γ 在建模6周和10周時(shí)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 圖 6 G,H,I) 。

2. 5 心臟組織病理學(xué)

在建模6周( 圖 7A,B)和10周( 圖 7C, D)時(shí)，CON組及CAD組小鼠胸主動(dòng)脈無斑塊形成，血管內(nèi)膜平滑，未見斷裂增厚，內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，中膜厚度正常，平滑肌細(xì)胞排列整齊，均未見泡沫細(xì)胞形成等動(dòng)脈粥樣硬化改變。

1. 1 材料

1. 1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)室自己繁育的無菌雌性 C57BL / 6J 小鼠28 只, 飼養(yǎng)于專用無菌隔離器，設(shè)施合格證號(hào):【SYXK ( 京 ) 2018 - 0019】。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度 21~25℃，濕度40% ~ 70%，光照周期明暗比 12 h:12 h。動(dòng)物自由攝入經(jīng) 50 kGy60Coγ 射線輻照消毒的定制無菌小鼠飼料。實(shí)驗(yàn)中使用的飲水、墊料、鼠盒、水瓶、灌胃針等均經(jīng)過 126℃ ,30 min 的高溫高壓滅菌處理。本實(shí)驗(yàn)已獲得中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)( IACUC )批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào):ZH17001。

1. 1. 2 試劑與儀器

抗體芯片檢測(cè)試劑：儀器校準(zhǔn)試劑盒 Bio-Plex Validation Kit ( Bio-Rad )；Bio-Plex Calibration Kit。( Bio-Rad ) 。檢測(cè)試劑盒 Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Grp ⅠPanel 23-plex ( 貨號(hào) M60009RDPD)。

主要儀器：懸液微珠芯片平臺(tái)，Bio-Plex MAGPIX System ( Bio-Rad)。組織脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica)、IQ5PCR儀 (美國(guó)Bio-Rad公司)。

1. 2方法

1. 2. 1志愿者信息

采集 2 位冠心病患者、1 位健康志愿者的新鮮糞便用于建立 HFA 模型( 表 1 ) 。 冠心病及健康志愿者均來自北京,為典型非素食中國(guó)飲食,體檢、血相正常;健康志愿者及冠心病患者的消化系統(tǒng)無其它器質(zhì)性疾病;消化道未進(jìn)行過手術(shù);無酗酒史、糖尿病及其它影響腸道菌群的問題;取樣前 8 周未服用處方藥、益生菌、抗生素、非甾體類藥物。冠心病患者符合世界衛(wèi)生組織/國(guó)際心臟病學(xué)會(huì)制定的冠心病診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1. 2. 2 模型建立

8 周齡雌性無菌 C57BL / 6J 28 只，分為健康對(duì)照組( CON) 與冠心病( CAD) 組,每組 14 只。收集 3位志愿者清晨第 1 次排出的新鮮糞便，無菌、厭氧條件下稱量 1 g 加入 100 mL 0. 1 mol / L PBS ( pH 7. 2)緩沖液，振蕩混勻，制成糞便菌懸液待用。分別向2組的每只無菌小鼠體內(nèi)經(jīng)口灌喂 0. 4 mL 糞便懸液，建立冠心病人源菌群動(dòng)物模型。

1. 3 檢測(cè)指標(biāo)

動(dòng)物每周稱體重, 在糞菌移植 6 周、10 周后每組分別安樂 7 只動(dòng)物,進(jìn)行以下指標(biāo)的檢測(cè):

1. 3. 1 腸道菌群16S rDNA 的檢測(cè)

動(dòng)物安樂死前在隔離器內(nèi)采集糞便，- 80℃ 冰箱冷凍保存。按參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行基 因組DNA 提取和 PCR 擴(kuò)增文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序及生物信息學(xué)分析。

1. 3. 2 血液學(xué)指標(biāo):

動(dòng)物用舒泰( 25 mg / kg) 麻醉后腹主動(dòng)脈取血，取血結(jié)束剪斷腹主動(dòng)脈放血將動(dòng)物安樂死。血液3000 r / min 離心 10 min 取上清,樣品送北京中同藍(lán)博臨床檢測(cè)有限公司，采用比色法進(jìn)行TG、TC、LDL-C、高密度脂蛋白( HDL-C)、LDH、CK的檢測(cè)。

1. 3. 3 細(xì)胞因子檢測(cè)

血液用 10 000 r / min 離心 10 min, 取上清。使用 Luminex 抗體芯片技術(shù)檢測(cè)血清中與粥樣硬化斑塊形成 相 關(guān) 的 細(xì) 胞 因 子: IL-1β、IL-2 、IL-4、IL-5、IL-6、INF-γ、IL-10 、IL-12 p7 0 、TNF-α 的濃度變化。

1. 3. 4 組織病理學(xué)

動(dòng)物安樂死后，打開胸腔,取出心臟,自升主動(dòng)脈處將心臟與主動(dòng)脈分離并切除心臟的下半部分，用 PBS 洗凈殘血后 4% 中性甲醛固定進(jìn)行 HE染色。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差( ???x ± s) 表示，SPSS 22. 0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析，組間比較使用 t 檢驗(yàn)，以 P< 0. 05 為差異有顯著性。

一、疾病概述

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病簡(jiǎn)稱冠心病，是一種非常常見的心血管疾病。截止到 2016 年的數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)城鄉(xiāng)居民因冠心病死亡 173. 6 萬(wàn)例。冠心病是一種遺傳因素與環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的慢性復(fù)雜性疾病。在遺傳因素方面，有文獻(xiàn)報(bào)道通過全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)了 46 個(gè)與冠心病相關(guān)的危險(xiǎn)基因，占冠心病遺傳因素的 10. 6%, 并且這些因素只與脂質(zhì)和血壓相關(guān)且穩(wěn)定性高，不易受飲食、性別、年齡和藥物的影響，從而使危險(xiǎn)基因較難成為預(yù)防治療冠心病的靶點(diǎn)。

二、研究背景

1、實(shí)驗(yàn)志愿者信息

采集冠心病人和健康志愿者糞便

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

無菌雌性 C57BL / 6J 小鼠

3、研究背景

腸道菌群作為環(huán)境因素的重要組成部分越來越受到研究者重視。直接利用人進(jìn)行腸道菌群研究存在倫理學(xué)限制，動(dòng)物模型是研究腸道菌群與宿主健康與疾病關(guān)系是必不可少的手段。由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道菌群組成及代謝活性與人存在顯著差異，因此將動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推到人不是完全可靠的。以無菌( germ free mice, GF) 小鼠為研究對(duì)象通過糞菌移植方式建立人源菌群( human flora-associated, HFA) 動(dòng)物模型，其微生物背景清晰，可有效控制遺傳基因、腸道微生物、飲食、性別年齡等因素造成的混雜性偏倚（Turnbaughet al. 2009;Faithet al. 2010）。本研究通過灌胃方式給無菌小鼠接種冠心病患者的新鮮糞便懸液建立冠心病HFA 動(dòng)物模型，為探索腸道菌群在冠心病發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

Turnbaugh PJ, Ridaura VK, Faith JJ, et al. The effect of diet on the human gut microbiome: ametagenomic analysis in humanized gnotobiotic mice [J] . Sci Transl Med, 2009, 1( 6): 6ra14.

Faith JJ, Rey FE, O ’ Donnell D, et al. Creating and characterizing communities of human gut

microbes in gnotobiotic mice [J] . ISME J, 2010, 4( 9) : 1094- 1098.