該模型的鑒與評價技術方法和指標體系包括（1）分子水平：模型鼠基因型及mRNA表達應符合5.1和5.2中指標要求。（2）細胞水平：該基因過表達對細胞增殖影響應符合5.3中指標要求。（3）整體水平：模型小鼠造血干細胞對TBI和競爭性移植的影響應符合5.4、5.5中指標要求。。

在病毒感染引起的先天性免疫應答，IFITM家族在其中起重要作用，但是關于該家族在其他方面的研究相對較少。通過前期的大數據分析，發現IFIMT6可能在造血干細胞的發育分化、衰老過程中發揮作用，為探明該基因在造血干細胞中的作用和機制，我們建立了該基因的敲除小鼠模型，通過初步研究發現該基因缺失，在正常情況下，分析造血干細胞分化發育的各譜系細胞，并未發現明顯差異，但是在TBI引起的造血干細胞損傷中起保護作用，并且通過競爭性移植實驗發現該基因缺失，能夠增強其競爭性能力，表明該基因缺失可能在外界刺激的情況下起保護作用，但是具體機制還需要進一步深入研究。

該基因敲除小鼠模型的建立，為該基因功能研究、病毒引起的先天性免疫應答研究、造血干細胞的功能研究等提供動物模型支撐。

模型制作及動物實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ZLF18004。本實驗部分使用了基因修飾動物（基因敲除），只在規定的SPF級動物設施內飼養，飼養過程有防逃逸的措施，如擋鼠板等。動物在離開動物設施后，進行完相關試驗后，立即進行處死，取材。動物尸體暫存于-20℃冰箱中，經有資質的公司運走統一處理。

4.1 IFITM6主要定位于細胞膜上 構建過表達IFITM6-Flag質粒，轉染293T細胞，通過用抗Flag抗體進行免疫熒光染色，結果表明IFITM6主要定位于細胞膜上（圖3A）。并對K562細胞中家族其他基因分析，發現IFITM1和IFITM2表達相對較高（圖3B），IFITM6過表達影響細胞增殖（圖3C）

圖3所示 在K562細胞中過表達影響細胞增殖

4.2 IFITM6敲除小鼠的建立

利用CRISPR/Cas9在IFITM6基因第二外線子選擇gRNA靶點，敲除第二外顯子。出生的小鼠經過設計包含靶點的引物（Table1），進行基因型鑒定，并進行插入序列的測序，最終獲得了敲除第二外顯子的小鼠，如圖3-a所示。隨后，我們通過雜合子雜交的方式獲得了純合敲除小鼠，并進行了表達分析，圖3-c顯示。結果表明我們成功建立了該基因的敲除小鼠模型。

圖3 IFITM6敲除小鼠的建立

Table 1 本文中用于基因型鑒定的引物信息

4.3 IFITM6敲除對家族其他成員的影響

我們分析了IFITM6敲除對家族其他成員的影響，結果表明IFIMT6敲除小鼠中，IFITM1表達升高，IFITM2和IFITM5表達下降，IFITM3表達變化不明顯（圖4所示）。

圖4 IFIMT6敲除對IFIMT家族其他成員表達的影響

4.4 IFITM6敲除影響LT-HSC

我們對該基因的敲除小鼠進行了造血干細胞分化、發育相關的流式分析，結果表明基因缺失對LSK影響不明顯，但對LT-HSC有促進作用，但是LT單克隆培養實驗發現，敲除后會造成克隆形成數減少，但不影響克隆大小和形態（圖5所示）。

圖5 IFITM6敲除影響HSC功能

4.5 IFITM6敲除在輻射引起的損傷（TBI）中起保護作用

我們對該基因敲除小鼠進行了輻射引起的損傷（TBI）實驗，結果顯示IFITM6敲除在TBI實驗中起保護作用，并且克隆形成能力明顯增加（圖5所示）。

圖6 IFITM6敲除在TBI實驗中起保護作用

4.6 IFITM6敲除影響骨髓競爭性移植

我們通過競爭性移植實驗，初步分析發現，IFITM6敲除在競爭性移植中起保護作用（圖7所示）。由于動物目前數量較少，需要進一步增加動物數量進一步核實。

圖7 競爭性移植實驗

5.1基因型鑒定

該模型鼠是通過CRISPR技術，將IFITM6的第二外顯子敲除，，因此，在基因水平鑒定，需要區分野生型、雜合子和純合子，鑒定引物為Table1中所列。

5.2基因表達情況

對敲除鼠組織取材，通過Q-PCR檢測檢測不到IFITM6基因的表達。

5.3 過表達K562細胞增殖的影響

該基因的表達主要定位于細胞膜上，過表達會影響K562細胞的增殖。

5.4 在TBI中的作用

該基因敲除在TBI引起的造血干細胞損傷過程中起保護作用。

5.5 該基因敲除對競爭性移植的影響

該基因敲除后，通過競爭性移植實驗，敲除細胞在受體鼠中占具數量優勢。

3.1 實驗材料

3.1.1 實驗動物

C57BL/6購自北京維通利華實驗動物技術有限公司 SCXK(京）2016-0006。超排用雌鼠數量10-15只，年齡3周齡，交配傳代用野生型鼠為成年8-10周齡小鼠。實驗中基因工程小鼠由本實驗室繁殖產生。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ZLF18004.

3.1.2實驗儀器

3.1.3實驗試劑

3.1.4 模型構建流程 利用CRISPR/Cas9技術制備IFITM6敲除小鼠。選擇敲除第二外顯子，來構建IFITM6敲除小鼠 (B6. IFITM6 (tm)-GC/ILAS)。該基因敲除的雜合子小鼠，相互雜交可以獲得該基因敲除的純合子小鼠，使用PCR方法進行基因型鑒定。3.1.5 IFITM6敲除小鼠的建立3.1.5.1 IFITM6敲除小鼠模型的建立(1) 設計方案

(2) 構建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expressionvector，根據基因信息選擇靶點并合成sgRNA。

靶點1:

M-Ifitm6-EA1-g-up: TAGGACTGGGATCTGGTATAGG

M-Ifitm6–EA1-g-down: AAACCCTATACCAGATCCCAGT

靶點2:

M-Ifitm6-EB1-g-up: TAGGGAGAATGCCCAGGGATTC

M-Ifitm6–EB1-g-down: AAACGAATCCCTGGGCATTCTC合成的sgRNA單鏈通過退火復性結合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構建完成的sgRNA載體通過體外轉錄成為可注射的sgRNA。

(3) 構建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過體外轉錄成為可注射的Cas9-RNA。

(4) 顯微注射

1) 超數排卵：10-15只3周齡雌鼠注射激素進行超排。

2) 受精卵注射：取約120枚受精卵進行注射。

3) 受體鼠制備：8-10周齡雌鼠與結扎的SD雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。

4) 胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，120枚卵，5只受體鼠）。

(5) 基因型鑒定

1) 剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進行編號及取材。

2) 基因組DNA提取：使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA

3) PCR檢測：根據序列信息設計檢測引物并進行PCR檢測。

(6) 結果分析：選取通過PCR檢測后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號，將PCR產物進行TA克隆，之后用檢測引物進行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。

(7) 根據測序結果確定IFITM6敲除小鼠模型(B6.IFITM6 (tm)-GC/ILAS)用于后續實驗。

3.1.5.2 動物繁殖和表達圖譜分析

獲得F0代后，首先通過與野生型鼠進行雜交，進行基因修飾鼠傳代能力分析。獲得能夠傳代的雜合子小鼠進行相互雜交，產生純合敲除小鼠并用于后續實驗。

圖 2. IFITM6敲除小鼠的繁育

3.1.5.3 鼠尾基因組DNA提取

在幼崽出生后剪腳趾標記，收集幼崽腳趾至1.5 mL EP管。然后參照DNA提取試劑盒（全式金）說明書按以下程序操作。

(1) 加入100μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃搖床孵育至完全裂解。

(2) 12000rpm 離心5min，轉移上清于一無菌的離心管中。

(3) 加入500μLBB2，立即渦旋5s，室溫孵育10min。

(4) 將全部的溶液加入離心柱中，8000rpm離心1min，棄掉流出液。

(5) 加入500μL CB2溶液，12000 rpm離心1min，棄掉流出液。

(6) 重復步驟（5）一次。

(7) 加入500μL WB2（使用前加入88 mL無水乙醇），12000rpm 離心1min，棄掉流出液。

(8) 重復步驟（7）一次。

(9) 10000rpm 離心2min，徹底去除殘留的WB2。

(10) 將離心柱置于一干凈的離心管中，開蓋靜置5min，在柱的中央加入50~200μL預熱EB（60℃~70℃），蓋上蓋子，室溫靜置3min，12000rpm 離心2min，洗脫DNA。保存至4℃冰箱。

一、疾病概述

固有免疫是機體防御外來病毒感染的第一道防線，通過識別病原并產生各種細胞因子、趨化因子、干擾素（IFN）等多種抗病毒因子。干擾素誘導的跨膜蛋白（IFITM家族），是一類具有抗病毒作用的ISG（干擾素誘導基因）的編碼產物，并證明其在多種生物過程中發揮作用，具有廣泛的抗病毒作用，并在免疫信號轉導、細胞歸巢等發揮作用。

IFITM家族包括IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5、IFITM6、IFITM7和IFITM10，除了IFITM5特異性表達與骨細胞，不依賴與IFN的表達，其余家族在IFN的調控下在多組織和器官廣泛表達。其中，FITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM10在人類中表達，FITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM6在小鼠中表達（圖1）。

圖1 IFITM家族成員 （a）人和小鼠的IFITM家族成員差異比較（b）IFITM家族的跨膜形式。

IFITM家族具有兩個輸水區，被一個稱為保守型細胞內環結構（CTL）保守區分開。IFITM在不同組織和細胞中，分布相對廣泛。IFITM1主要位于細胞膜和早期內體，能夠與細胞表面分子CD19和CD81相互作用。報道顯示CD81是HCV的受體，表明IFITM1可能與HCV感染進入細胞存在相關性。IFITM2和IFITM3主要存在于晚期內體和溶酶體，并于Ras相關蛋白RAB7、CD63和LAMP1共定位。通過功能基因組篩選，發現IFIMT1、IFIMT2、 IFIMT3，能夠被1型和2型IFN誘導表達，并對于IFN抑制流感性病毒發揮重要作用。IFITM3基因敲除小鼠模型，在感染流感病毒后引起爆發性病毒肺炎，重新基于IFIMI3可以逆轉病情。已有的研究還表明IFIMT家族還參與Th1和Th2細胞的分化調節（圖2所示）。IFIMT5參與成骨細胞和礦物鹽沉積。IFITM10在不同物種中的同源非常高，高達85%以上，但是功能仍是未知。通過敲除小鼠的IFITM3, IFITM5，和IFITM 6基因后，發現能夠影響Th1細胞的分化，但是IFITM6的具體功能仍不清楚。

圖2 IFTIM家族參與Th1和Th2的分化調節

IFITM作為固有免疫系統IFN效應的重要元件，在病毒性疾病的防御過程中發揮重要作用。由于IFITM參與調節機體的固有免疫，在病毒引起的疾病機制中具有重要作用。IFITM敲除的小鼠在Th2設計的免疫病理和應答中起保護作用。IFITM家族作為抗病毒治療的有效靶點，能夠抑制病毒入胞和復制，這對病毒感染相關疾病的預防和治療提供可能的新的藥物靶點。

1、基因信息

干擾素誘導膜蛋白6（interferon induced transmembrane protein 6 ，Ifitm6，GENE ID：213002），由IFITM6基因所編碼，功能不明確，可能在Th2細胞的分化過程中起作用。

細胞：K562細胞（人類紅白血病細胞系），源自一個53歲的女性慢性髓性白血病爆發期病人的淋巴母細胞。293T細胞，人腎上皮細胞系，同時表達 SV40 大 T 抗原。

2、實驗動物背景信息

實驗所用小鼠（C57BL/6）背景。C57BL/6小鼠也被稱為C57 black6，也稱作B6。1921年被培育出來，屬于近交品系。該品系的最主要的兩個特點就是品系穩定和易于繁殖。主要用途包括：作為生理學與病理學的實驗動物模型、構建轉基因動物模型、作為產生自發突變和誘發突變的同基因型小鼠的背景品系。該品系在國內使用頻率高，價格相對便宜。

3、研究背景

在固有免疫系統中，IFITM作為固有免疫系統IFN效應的重要元件，在病毒性疾病的防御過程中發揮重要作用。除在固有免疫系統中發揮作用，IFITM家族還參與其他生理功能，如IFIMT5參與成骨細胞和礦物鹽沉積。我們在前期工作中，通過造血干細胞的高通量測序和表達分析，篩選到基因IFITM6，表明該基因可能在造血干細胞的相關的生物學功能中發揮作用。IFITM6在小鼠造血干細胞中是否發揮作用，以及擁有怎樣的生物學功能，需要進一步研究進行闡述。

目前尚沒有IFITM6的基因敲除小鼠，構建該基因的敲除小鼠，分析該基因敲除后的表型以及在造血干細胞中的功能，該項目不僅為該基因在造血干細胞中的功能提供實驗基礎，同時也為該基因在病毒感染的先天性免疫機制研究中提供動物模型。

參考文獻：

【1】Yánez DC, Ross S, Crompton T. The IFITM protein family in adaptive immunity.Immunology. 2020 Apr;159(4):365-372. doi: 10.1111/imm.13163. Epub 2019 Dec 22.

【2】Yánez DC, Sahni H, Ross S, Solanki A, Lau CI, Papaioannou E,Barbarulo A, Powell R, Lange UC, Adams DJ, Barenco M, Ono M, D'Acquisto F,Furmanski AL, Crompton T. IFITM proteins drive type 2 T helper celldifferentiation and exacerbate allergic airway inflammation. Eur J Immunol.2019 Jan;49(1):66-78. doi: 10.1002/eji.201847692. Epub 2018 Nov 9.

【3】Smith S, Weston S, Kellam P, Marsh M. IFITM proteins-cellularinhibitors of viral entry. Curr Opin Virol. 2014 Feb;4:71-7. doi:10.1016/j.coviro.2013.11.004. Epub 2014 Jan 28.

【4】Shi G, Ozog S, Torbett BE, Compton AA. mTOR inhibitors lower an intrinsicbarrier to virus infection mediated by IFITM3. Proc Natl Acad Sci US A. 2018 Oct 23;115(43):E10069-E10078. doi: 10.1073/pnas.1811892115. Epub 2018Oct 9.

【5】Li K, Markosyan RM, Zheng YM, Golfetto O, Bungart B, Li M, Ding S,He Y, Liang C, Lee JC, Gratton E, Cohen FS, Liu SL. IFITM proteins restrictviral membrane hemifusion. PLoS Pathog. 2013 Jan;9(1):e1003124. doi:10.1371/journal.ppat.1003124. Epub 2013 Jan 24.

【6】Zhao X, Li J, Winkler CA, An P, Guo JT. IFITM Genes, Variants, and Their Roles in the Control andPathogenesis of Viral Infections. FrontMicrobiol. 2019 Jan 8;9:3228. doi: 10.3389/fmicb.2018.03228. eCollection 2018.

【7】Hickford D, Frankenberg S, Shaw G,Renfree MB. Evolution of vertebrate interferon inducible transmembraneproteins. BMC Genomics. 2012 Apr 26;13:155. doi: 10.1186/1471-2164-13-155.

【8】Rodriguez Celin M, Moosa S, Fano V. UncommonIFITM5 mutation associated with severe skeletal deformity in osteogenesisimperfecta. Ann Hum Genet. 2018 Nov;82(6):477-481. doi: 10.1111/ahg.12275. Epub2018 Jul 24.

【9】Lazarus S, McInerney-Leo AM, McKenzie FA, Baynam G, Broley S, CavanBV, Munns CF, Pruijs JE, Sillence D, Terhal PA, Pryce K, Brown MA, Zankl A,Thomas G, Duncan EL. The IFITM5 mutation c.-14C > T results in an elongatedtranscript expressed in human bone; and causes varying phenotypic severity ofosteogenesis imperfecta type V. BMC Musculoskelet Disord. 2014 Mar 27;15:107.doi: 10.1186/1471-2474-15-107.

【10】Hanagata N, Li X, Morita H, Takemura T, Li J, Minowa T. Characterizationof the osteoblast-specific transmembrane protein IFITM5 and analysis ofIFITM5-deficient mice. J Bone Miner Metab. 2011 May;29(3):279-90. doi:10.1007/s00774-010-0221-0. Epub 2010 Sep 14.